ВІДНОВЛЕННЯ КІСТКОВОГО ПАРОДОНТАЛЬНОГО ДЕФЕКТУ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИМ МАТРИКСОМ З ГІАЛУРОНОВОЮ КИСЛОТОЮ ТА ТРОМБОЦИТАРНИМИ ФАКТОРАМИ РОСТУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

191

DOI 10.35220/2078-8916-2020-36-2-10-16

УДК 616.314.17/18+611.08

С.А. Шнайдер, д. мед. н., Г.О. Вишневська, к. мед. Н., *З.Ш. Какабадзе
Державна установа «Інститут стоматології
та щелепно-лицевої хірургії Національної академії
медичних наук України»
*Тбіліський державний медичний університет

Порівняльний аналіз загоєння пародонтального кісткового дефекту в ділянці молярів на нижній щелепі з використанням різних видів біологічно активних матеріалів, а саме децелюллярізірованной амніотичної мембрани, децелюллярізірованной амніотичної мембрани в поєднанні з факторами росту PRP і децелюллярізірованной амніотичної мембрани в поєднанні з факторами росту PRP і гіалуроновою кислотою, показав, що регенерація кісткового дефекту при ушиванні його слизовою оболонкою за 2 місяці відбувається у всіх порівняльних групах. Але якість отриманої кістки дуже відрізняється за наявністю кількості кровоносних судин. Так в першій групі (контрольній) судини практично відсутні, а в 3 і 4 групі наявність судин відзначається на препаратах вже з 14 доби. Так само і сам процес створення новосформованої кістки відбувається швидше в 3 і 4 групах порівняно з 1 і 2. Після проведених морфологічних досліджень можна рекомендувати застосування біологічно активних матеріалів в комбінації з факторами росту PRP та гіалуроновою кислотою для регенерації кісткових пародонтальних дефектів.

Ключові слова: фактори росту PRP, гіалуронова кислота, регенерація, неоангеогенез, пародонтальний дефект.

Сучасна стоматологія широко використовує велику кількість регенеративних матеріалів таких як алотрансплантати, ксенотрансплантати та синтетичні матеріали для загоєння пародонтальних дефектів. Крім того є біологічно активні мембрани, які також застосовують для регенерації пародонта. Науково доведено, що ці замісники кістки мають остеокондуктивні властивості при загоєнні дефектів та слугують механічним каркасом для формування нової кістки [1]. Тромбоцитарні фактори росту PRP такі як трансформуючий фактор роста-β (TGF-β), фактор роста тромбоцитів (PDGF), сосудинний ендотеліальний фактор роста (VEGF), інсуліноподібний фактор роста (IGF), епітеліальний фактор роста (EGF) та фактор роста фібробластів-β (FGF-β) мають потенціал для покращення загоєння ран за рахунок посилення неоангіогенеза, проліферації та диференціювання [2]. Алогенний амніотичний матрікс є тонкою, пружною, прозорою, абсорбіруємою мембраною яка має велику кількість факторів росту, індукує ангіогенез, поліпшує міграцію клітин, має протизапальні, антимікробні та іммуностимулюючі властивості які допомагають прискорити формування нової тканини [3-6].

В літературі можна знайти велику кількість публікацій, які оцінюють вплив біологічно активних матеріалів на регенерацію тканин пародонта та результати цих досліджень часто суперечливі [7]. Тому і зараз лишається відкритим питання про те чи доцільно застосовувати біологічно активні препарати для прискорення регенерації пародонтального дефекту.

Мета дослідження. Оцінка додаткових біологічно активних матеріалів, таких як децелюлярізованна амніотична мембрана, фактори росту PRP та гіалуронова кислота для відновлення кісткової тканини при пародонтальних дефектах в експерименті.

Матеріали і методи дослідження. Для досліджень в якості експериментальної тварини були обрані 96 білих лабораторних щурів лінії Вістар, обох статей, масою 200-250 г і 1 щур був донором для отримання крові для виготовлення PRP. Після евтаназії шляхом внутрішньочеревного введення летальної дози 0,5 % розчину тіопенталу натрію у щура збирали кров в пробірку, яку потім поміщали в центрифугу Kokusan H-9R (Японія). Виконували центрифугування в режимі 1600 обертів протягом 20 хвилин при температурі 29°С. Після центрифугування з пробірки відбирали верхній і середній шари і переносили їх в чисту пробірку, яку поміщали в центрифугу, і виконували друге центрифугування в режимі 400 обертів протягом 15 хвилин. Таким чином була отримана плазма, розділена на 2 фракції: верхній шар – плазма, збіднена тромбоцитами; нижній шар – плазма, збагачена тромбоцитами. Для отримання біологічно-активної мембрани в комбінації з факторами росту PRP та гіалуроновою кислотою 1 мл PRP змішували з 0,5 мл гіалуронової кислоти в стерильній чашці. Ліофілізовану амніотичну мембрану поміщали в чашку Петрі і проводили регідратацію 0,9 % розчином NaCl протягом 40 хвилин. Далі, регідрованну амніотичну мембрану поміщали на стерильний столик і покривали її передню поверхню PRP з гіалуроновою кислотою. Після цього мембрану перевертали і покривали зворотній бік мембрани також використовуючи PRP і гіалуронову кислоту.

Тварини були розділені на 4 групи по 24 в кожній. Всім тваринам попередньо створювали моделі дефекту кістки альвеолярного відростка нижньої щелепи. В умовах загальної анестезії слизову оболонку і окістя альвеолярного відростка нижньої щелепи відшаровували від кістки, створюючи повношаровий клапоть і хірургічним бором з водяним охолодженням (швидкість обертання 10000 оборотів) створювали дефект кістки з вестибулярної сторони в ділянці молярів на нижній щелепі (мал. 1). Після формування дефекту кістки округлої форми, діаметром 3 мм у тварин першої групи (n = 24, 12 самців і 12 самок) відсепарований клапоть повертали на місце (мал. 2) та ушивали його вузловими швами з використанням атравматическої голки 7/0 (Ethicon). Ця група була контрольною.


Мал. 1. Дефект кістки з вестибулярної сторони в ділянці молярів на нижній щелепі.

Тваринам другої групи (n = 24, 12 самців і 12 самок) дефект кістки відновлювали децелюлярізірованною регідрірованою амніотичною мембраною, і закривали відсепарованим клаптем, який фіксували вузловими швами з використанням атравматическої голки 7/0 (Ethicon). Розмір і форма амніотичної мембрани була адаптована до розміру дефекту.

Тваринам третьої групи (n = 24, 12 самців і 12 самок) дефект кістки відновлювали децелюлярізірованною регідрірованою амніотичною мембраною з нанесеним на її поверхню PRP.

Мал. 2. Дефект кістки покривали слизовою та ушивали вузловими швами.

Тваринам четвертої групи (n = 24, 12 самців і 12 самок) дефект кістки відновлювали децелюлярізірованною регідрірованою амніотичною мембраною з нанесеним на її поверхню PRP та гіалуроновою кислотою.

У другій, третій і четвертій групах після відновлення дефекту кістки ДАМ, ДАМ + PRP і ДАМ + PRP + ГК закривали відсепарованим клаптем, який фіксувався вузловими швами з використанням атравматичної голки 7/0 (Ethicon).

Після операції тварини утримувалися в стандартних умовах віварію і виводилися з експерименту на 7, 14, 20 добу та 2 місяці після операції внутрішньочеревною ін’єкцією летальної дози 0,5 % розчину тіопенталу натрію.

Оцінку регенерації кісткового дефекту проводили за допомогою морфологічних досліджень. Посічені тканини поміщали в 10 % розчин формаліну, потім заливали в парафінові блоки і готували зрізи товщиною 5 мкм. Зрізи фарбували гематоксилін-еозином. Візуалізацію мікропрепаратів проводили на світловому мікроскопі (Олімпус, Японія).

Результати та їх обговорення. В групі з природньою регенерацією кісткової тканини на 7-й день було виявлено, що отвір частково заповнено елементами крові, на деяких ділянках в дефекті кістки були присутні елементи сполучної і грануляційної тканини (мал. 3.). На 14-й день на тлі грануляційної тканини зазначалась наявність острівців хрящової тканини. Також можна відзначити наявність в дефекті ділянок молодої кісткової тканини (мал. 4.). На 20-й день кістковий дефект практично повністю був закритий молодою кістковою тканиною, в якій зазначалося хаотичне розташування кісткових балок (мал. 5.). Через 2 місяці кістковий дефект був повністю закритий кістковою тканиною. Про наявність дефекту можна було судити по збереженому хаотичному розташуванню кісткових балок (мал. 6.).

При закритті кісткового дефекту децелюлярізірованною і ліофілізованою амніотичною мембраною (друга група) відзначався процес активної регенерації. Так як амніотична мембрана людини має гладку поверхню, добре розташовується в ділянці дефекту кістки, заповнюючи його. На мікропрепаратах на 7 день дослідження можна виявити наявність частково збереженої мембрани з великою кількістю клітинних елементів крові (мал. 7.).

На 14-й день, отвір було частково закрито новоствореною кістковою тканиною з наявністю кровоносних судин по межі дефекту. Багатоядерні клітини остеобласти та неоангеогенез судин (мал. 8.).

На 20-й день кістковий дефект був закритий новоствореної кістковою тканиною з великою кількістю кровоносних судин. В полі зору на препаратах відмічалась велика кількість клітин остеобластів (мал. 9.).

Через 2 місяці зазначалося наявність сформованої кісткової тканини в області дефекту, в полі зору були остеоцити та судини. (мал.10.).

У третій групі щурів після закриття кісткового дефекту децелюлярізірованною і ліофілізованою амніотичною мембраною з PRP вже через тиждень з’являлась наявність великої кількості ділянок новосформованої кістки, але при цьому можна було виявити і велику кількість запальних клітинних елементів (мал. 11.).

На 14-й день дефект кістки був закритий молодою кістковою тканиною з великою кількістю повнокровних кровоносних судин по краю дефекту. Клітинні елементи, що вказують на наявність запалення, були відсутні. В полі зору були присутні остеобласти та судини(мал. 12.).

На 20-й день отвір в кістці було повністю закрито кістковою тканиною з хаотично розташованими кістковими балками, кісткова тканини відрізнялась від попередніх двох груп великою кількістю кровоносних судин (мал. 13.).

Через 2 місяці, як і в інших двох групах, під час гістологічного дослідження відзначалася сформована кісткова тканина (мал. 14.).

У четвертій групі тварин після закриття кісткового дефекту децелюлярізірованной і ліофілізованої амніотичної мембраною з гелем PRP та гіалуроновою кислотою вже через 7 днів зазначалась наявність великої кількості ділянок «молодої» кістки, але при цьому також були присутні запальні елементи (мал. 15.).

На 14-й день дефект кістки був закритий відновленою кістковою тканиною з великою кількістю кровоносних судин, але все ще лишались в полі зору елементи запалення (мал. 16.).

На 20-й день ділянку дефекту було повністю відновлено кістковою тканиною зі сформованими судинами (мал. 17.) .

Через 2 місяці під час морфологічного дослідження у препаратах була наявна сформована кісткова тканина (мал. 18.).

Висновки. Таким чином, за результатами гістологічних досліджень можна зробити висновок, що регенерація кісткового дефекту через 2 місяці відбулась у всіх трьох групах. Але на 14-й день в першій групі, на відміну від другої, третьої та четвертої груп, практично не відзначається судин. У третій групі на відміну від другої на 7-й день відзначається наявність запальних елементів, але при цьому вже виявляються ділянки новосформованої кістки, що вказує на активну регенерацію кісткової тканини. В четвертій групі так само довше ніж у 1 та 2 групах присутні елементи запалення, але і в більш ранні строки відмічається поява новосформованої кістки та більша кількість судин. Що дає можливість рекомендувати використання додаткових біологічно активних матеріалів, децелюлярізованної амніотичної мембрани, факторів росту PRP та гіалуронової кислоти для відновлення кісткової тканини при пародонтальних дефектах.

Висновки. Таким чином, за результатами гістологічних досліджень можна зробити висновок, що регенерація кісткового дефекту через 2 місяці відбулась у всіх трьох групах. Але на 14-й день в першій групі, на відміну від другої, третьої та четвертої груп, практично не відзначається судин. У третій групі на відміну від другої на 7-й день відзначається наявність запальних елементів, але при цьому вже виявляються ділянки новосформованої кістки, що вказує на активну регенерацію кісткової тканини. В четвертій групі так само довше ніж у 1 та 2 групах присутні елементи запалення, але і в більш ранні строки відмічається поява новосформованої кістки та більша кількість судин. Що дає можливість рекомендувати використання додаткових біологічно активних матеріалів, децелюлярізованної амніотичної мембрани, факторів росту PRP та гіалуронової кислоти для відновлення кісткової тканини при пародонтальних дефектах.

References

  1. Kao R. T., Conte G., Nishimine D. et al. Tissue engineering for periodontal regeneration. Journal of the Califomia Dental Association. 2005;3(33): 205–215.

  2. Dohan D. M., Choukroun J., A. Diss et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 2006; 3(101): E37–E44.

  3. Rana M. P., Mehrotra N. Human amniotic membrane: hope in periodontal regeneration. International Journal of Science and Research (IJSR). 2016;4(5): 564–569.

  4. Mishra S., Singh S. Human amniotic membrane: Can it be a ray of hope in periodontal regeneration? Indian Journal of Medical Research, vol. 3, no. 9, pp. 118–121, 2014.

  5. Niknejad H., Peirovi H., Jorjani M. et al. Properties of the Amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials Journal. 2008; 1(5):88-89.

  6. Takizawa S., Yamamoto T., Honjo K.I., Sato Y., Nakamura K., Yamamoto K., Adachi T., Uenishi T., Oseko F., Amemiya T., Yamamoto Y., Kumagai W., Kita M., Kanamura N. Transplantation of dental pulp-derived cell sheets cultured on human amniotic membrane induced to differentiate into bone. Oral Dis. 2019 Jul;25(5):1352-1362. doi: 10.1111/odi.13096. Epub 2019 Apr 29.

  7. Zhou S., Sun C., Huang S., Wu X., Zhao Y., Pan C.,Wang H., Liu J., Li Q., Kou Y. Efficacy of Adjunctive Bioactive Materials in the Treatment of Periodontal Intrabony Defects: A Systematic Review and Meta-Analysis. Biomed Res Int. 2018 May 27;2018:8670832. doi: 10.1155/2018/8670832. eCollection 2018.

Інформацію надав доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії України в галузі науки і техніки, директор ДУ «Інститут стоматології та щелепно-лицевої хірургії НАМН України».